Что такое вирусы и как с ними бороться

Сборка вирусных частиц

Репликационный цикл и точки приложения антиретровирусных агентов. Сборка и созревание – часть VI

Набор белковых «заготовок» ВИЧ и вирусная РНК транспортируются к мембране клетки, где происходит сборка вируса. Полипротеины, предшественники вирусных белков, самостоятельно опосредуют связывание с мембраной клетки и концентрацию всех вирусных компонентов в сферическое образование, которое является незрелым вирусом.

Электронная микроскопия флуоресцентно меченных белков Gag на плазматической мембране. Цветовая гамма инвертирована от оригинальной. Gross L.P Reconfirming the Traditional Model of HIV Particle Assembly. LoS Biol. 2006 Dec;4(12):e445.

На определенном этапе созревания вирус «в черновой отделке» покидает клетку, прихватывая с собой часть ее мембраны и белков клетки так, как если бы квартира из нового дома отправилась в самостоятельное путешествие с внешней стеной дома. Но данная частица еще не готова, и процесс созревания продолжается.

Этапы сборки и созревания. Адаптировано по Mailler E, Bernacchi S, Marquet R. и др.The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 2016 Sep 10;8(9). pii: E248.

В процессе сборки и созревания вируса белковые «заготовки» разрезаются на готовые вирусные белки. Например, полипротеин gp160 расщепляется в аппарате Гольджи клетки на белки gp41 и gp120 при помощи клеточного фермента фурина, а вот для подготовки из полипротеинов Gag (p55) и Gag-Pol (p160) целевых белков требуется вирусный фермент протеаза ВИЧ, та, что наряду с обратной транскриптазой и интегразой, в готовом виде присутствует в зрелом вирусе. Протеаза, «разрезая» на девяти участках «заготовки» полипротеинов Gag (p55) и Gag-Pol (p160), формирует группу зрелых белков, необходимых для сборки полноценного инфицирующего вируса.

Схема незрелого (слева) и зрелого (справа) вириона, а также соответствующие фото криоэлектронной микроскопии. Адаптировано по Sundquist WI, Kräusslich HG. HIV-1 assembly, budding, and maturation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Jul;2(7):a006924.

Ингибиторы протеазы препятствуют разделению полипротеиновых комплексов Gag и Gag-Pol протеазой ВИЧ на функциональные вирусные ферменты: протеазу, интегразу и обратную транскриптазу. Без данных ферментов вирусная частица не сможет эффективно инфицировать клетку. В классе представлены следующие препараты: атазанавир , дарунавир , фосампренавир , Калетра (лопинавир/ритонавир), саквинавир , типрановир и экспериментальный TMC-310911 .

Ингибиторы созревания блокируют разделение протеазой ВИЧ длинной белковой цепи, которая кодируется вирусным геном Gag, и содержит ряд протеинов суперкапсида и капсида вируса (матриксный белок p17, капсидный белок p24 и другие). Данные белки играют важную роль в процессе формирования зрелого вируса, а блокировка обработки этих белков приводит к выходу вируса, не способного инфицировать клетки. В классе изучались две молекулы: GSK3532795 и MPC-4326 , исследования прекращены в обоих случаях.

Читайте также:  Цефазолин; инструкция по применению, описание, вопросы по препарату

Так выделены в тексте вышедшие на рынок тех или иных стран препараты, синим выделены препараты, которые находятся в различных стадиях клинических испытаний, и таким цветом обозначены препараты, разработка и исследование которых прекращены.

Конструирование лентивирусов

Лентивирусные векторы являются высокоэффективным средством для доставки чужеродной ДНК в различные типы клеток и находят широкое применение в молекулярно-биологических и биомедицинских исследованиях in vitro и in vivo.

Для создания целевых конструкций используется самоинактивирующийся вектор третьего поколения на основе дефектного вируса иммунодефицита человека, в котором удалено около 80% нуклеотидной последовательности генома HIV-1. Вектор кодирует только переносимую ДНК, и содержит cis-элементы, необходимые для ее упаковки и интеграции.

Преимущества лентивирусных векторов:

Любая нуклеотидная последовательность по выбору заказчика.

Последовательность ДНК для конструирования лентивируса может быть синтезирована или клонирована из предоставленного заказчиком материала (плазмидный вектор, РНК, образец тканей).

СЕРВИСКАТ.#ОПИСАНИЕЦЕНА, РУБ.СРОК ВЫПОЛНЕНИЯ
* Цена и сроки выполнения услуги зависят от длины целевой последовательности, необходимости дополнительных работ по клонированию этой последовательности из биологического материала или ее синтеза. Воспользуйтесь формой для расчета цены сервиса on-line для уточнения цены и формирования заказа.
Конструирование лентивирусов Конструирование лентивирусного вектора, кодирующего указанную заказчиком последовательность ДНК под контролем универсального промотора.
Наработка лентивирусных частиц с титром в клетках 293Т в культуральной среде DMEM.
зависит от комплектации заказа* зависит от комплектации заказа*

Сборка лентивирусных частиц происходит в результате коэкспрессии в 293Т клетках хелперных плазмид, кодирующих оболочку вируса везикулярного стоматита и структурные белки вирусных частиц, и генома лентивирусного вектора. Через 2 дня культуральную жидкость, содержащую частицы ленти-вектора, собирают, фильтруют, и определяют титр частиц. Титр частиц, содержащих ген флюоресцентного белка, определяется на трансдуцированных клетках HEK293, титр прочих частиц — по концентрации вирусного капсидного белка р24 в иммуноферментном анализе.

Результат работы (передается Заказчику):

1. ДНК сконструированного лентивирусного вектора, в количестве не менее 3 мкг
2. 10 мл готовых к работе лентивирусных частиц с 10 5 -10 6 TU/мл в среде DMEM
3. Карта вектора и отчет о результатах работы и проверки титра.

Правила безопасности при работе с лентивирусными векторами

В настоящее время векторы третьего поколения являются наиболее безопасной лентивирусной системой. Хотя лентивирусные векторы не способны к саморепликации и инфекционному циклу, широкий тропизм оболочки VSV-g может привести к ненаправленному переносу трансгена при непосредственном контакте с частицами. Поэтому при манипуляциях с лентивирусными векторами необходимо придерживаться правил работы с патогенами третьей-четвертой групп безопасности. Технология самоинактивации обеспечивает, что после интеграции в геном клетки-мишени вирусный геном не способен к репликации, поэтому вероятность возникновения репликационно-компетентного вируса (RCV) в культуре трансдуцированных клеток ничтожно мала. Проверка безопасности культур трансдуцированных клеток проводится с помощью анализов на белок р24.

Вниманию заказчика

В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.

Работа с патогенными организмами

Компания Евроген не принимает биологические материалы, которые могут представлять угрозу инфицирования человека, животных или растений. В случае, если биологический материал, не являясь опасным, получен из или связан с патогенными организмами, организация, где работает Заказчик, должна подтвердить, что указанный материал не является инфекционным и предназначен для научно-исследовательских целей.

Конфиденциальность

Евроген сохраняет за собой неэксклюзивное право использовать полученные в процессе выполнения заказа материалы в коммерческих целях, если подобное использование не нарушает права на интеллектуальную собственность заказчика. Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе выполнения и обсуждения заказа.

Сборку вирусных частиц впервые засняли на видео


Garman et al. / PNAS, 2019

Одни из возможных способов бороться с патогенными вирусами — блокировать их сборку; так они не смогут выходить из клеток и расселяться по организму. Но для этого необходимо разобраться с тем, как именно эта сборка происходит. Строение капсидов — белковых структур, внутри которых заключены молекулы нуклеиновых кислот вируса — мы уже неплохо себе представляем, а вот как именно из молекулярного раствора возникает упорядоченная симметричная конструкция, все еще неясно.

Рис Гарман (Rees Garmann) и его коллеги из Гарвардского университета изучали динамику сборки вирусного капсида. Их модельным объектом был маленький РНК-содержащий вирус, который заражает клетки кишечной палочки — бактериофаг MS2. Чтобы его рассмотреть, исследователи использовали интерферометрическую рассеивающую микроскопию: суть ее в том, что прибор собирает свет, который рассеивают объект и фон.

Исследователи зафиксировали отдельные молекулы вирусных РНК на подложке и ввели в раствор вирусные белки. Под микроскопом они обнаружили растущие темные пятна. Ученые поставили параллельный эксперимент под трансмиссионным электронным микроскопом, в котором можно было рассмотреть не только размер, но и структуру поверхности частицы. Оказалось, что это действительно капсиды. Их сборку удалось заснять на видео, в среднем она заняла около 300 секунд.


Строение капсида (А), дизайн эксперимента (В), вид в микроскоп (С) и динамика построения капсида (D).
Garman et al. / PNAS, 2019

Поэтому авторы работы предположили, что для построения вирусной частицы необходимо сначала некоторое белковое ядро, на которое потом садятся остальные молекулы. Вероятно, разница во времени объясняется именно этим: в некоторых частицах оно случайно образуется раньше, а в других — позже. После того, как частица начала расти — то есть ядро сформировалось — рост идет необратимо. Такой вывод исследователи сделали из того, что размеры частиц растут, но никогда не уменьшаются.

Затем ученые повторили свои эксперименты, изменяя концентрацию белков. Они обнаружили, что чем больше белков в растворе, тем быстрее образуются ядра капсида. Время, которое уходит на рост частицы, тоже снижается, но медленнее, чем время образования ядра. Это наблюдение позволило им объяснить аномальные формы капсидов, которые иногда встречаются у разных вирусов.

Если белков не очень много, скорость образования ядра ниже, чем скорость роста, и формируются обычные замкнутые капсиды. Если белков становится больше, то ядра образуются с той же скоростью, что и растет капсид, и получаются «двуглавые» структуры. Если увеличивать концентрацию белков дальше, то возникают «многоголовые монстры», поскольку ядра образуются в больших количествах на еще недоросших капсидах.


Соотношение фаз нуклеации (образования ядра) и роста в зависимости от концентрации белков (А) и образующиеся при этом структуры (В).
Garman et al. / PNAS, 2019

Таким образом, ученым удалось впервые зафиксировать на видео процесс сборки вируса и показать, что он состоит из двух этапов: образования ядра и роста капсида. Исследователи полагают, что это важное приспособление к существованию внутри клеток: пока концентрация вирусных белков низкая, ядро формируется крайне медленно, и вирус продолжает размножаться внутри клетки. Полноценные же капсиды начинают образовываться только тогда, когда белков становится достаточно много для формирования ядра.

Раньше ученые рассмотрели, как вирус иммунодефицита человека проникает в ядро клеток, с помощью специально разработанного метода ViewHIV.

Ссылка на основную публикацию
Что такое атрофический очаговый гастрит Симптомы и лечение заболевания
Субатрофический гастрит: лечение и диета На что жалуются пациенты При незначительных очагах поражения слизистой, жалоб может и вовсе не быть,...
Что представляет собой кандидоз полости рта лечение поражённой ротовой полости, фото, профилактическ
Кандидоз полости рта Кандидоз полости рта является грибковым заболеванием. Наиболее заметен кандидоз языка, так как остальная слизистая просматривается не так...
Что приготовить ребенку от 1 года до 3 лет Кулинарные рецепты от Гуру на любой вкус
Меню на неделю для ребенка 2 – 3 лет Правильное питание – основа и залог здорового образа жизни. Если взрослые...
Что такое БАС Информационный портал о БАС
Болезнь двигательного нейрона Болезни двигательного нейрона: Боковой амиотрофический склероз Первичный латеральный склероз Прогрессирующая мышечная атрофия Прогрессирующий бульбарный паралич Псевдобульбарный паралич...
Adblock detector